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27.02.2025 14:10
Nanoskopie mit fokussiertem Licht ohne ON/OFF
Die STED- und PALM/STORM-Mikroskopie sowie alle anderen superauflösenden Fluoreszenzmikroskope liefern Auflösungen von einem Bruchteil der Lichtwellenlänge (Nanometer). Doch um benachbarte Fluoreszenzmoleküle getrennt abzubilden, müssen diese zeitweilig in einen nicht-leuchtenden, dunklen Zustand (OFF) überführt werden. Ein Team um Stefan Hell hat nun permanent leuchtende Moleküle bis auf wenige Nanometer getrennt – ohne einen dunklen Zustand zu verwenden. Das neue Konzept der Superauflösung sollte zukünftig auch für kontrastreiche, nicht-fluoreszierende Moleküle sowie Abbildungsverfahren, die auf nicht-optischen Wellen basieren, anwendbar sein.
Die Überwindung der Auflösungsgrenze im Lichtmikroskop von etwa einer halben Lichtwellenlänge (ca. 250 Nanometer) zählt zu den bedeutenden Entwicklungen in der Optik. Aufgrund der Wellennatur des Lichts kann selbst die beste Linse keinen feineren Lichtfleck als einen von 250 Nanometer Durchmesser produzieren. Alle Moleküle, die sich innerhalb dieses hellen Lichtflecks befinden, werden auf einmal beleuchtet, leuchten zusammen auf und erscheinen daher untrennbar als verwaschenes Ganzes. Stefan Hell erkannte Anfang der 1990er-Jahre, dass man Moleküle dennoch trennen kann, wenn man das Leuchten dieser Moleküle kurz aus- und einschaltet, und zwar so, dass eng benachbarte Moleküle gezwungen sind, nacheinander zu leuchten. Leuchten Moleküle nacheinander, können sie unterschieden werden. Der Schlüssel zur Überwindung der Auflösungsgrenze war also, die Moleküle kurz zwischen einem leuchtenden „ON“- und einen nicht leuchtenden „OFF“-Zustand zu schalten.
Da sich fluoreszierende Moleküle gut an- und ausschalten lassen, konnte man dieses ON-/OFF-Prinzip in der Fluoreszenzmikroskopie hervorragend umsetzen und so die Auflösungsgrenze vollständig überwinden. In der Tat beruhen STED und PALM/STORM, wie auch alle späteren superauflösenden Fluoreszenzmikroskope auf diesem ON/OFF-Prinzip. Im Jahre 2014 erhielten Stefan Hell sowie die US-amerikanischen Wissenschaftler Eric Betzig und William E. Moerner für die Entwicklung der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie den Nobelpreis für Chemie.
Superauflösung ohne ON/OFF
Wissenschaftler um Hell vom Göttinger Max-Planck-Institut (MPI) für Multidisziplinäre Naturwissenschaften und vom Heidelberger MPI für medizinische Forschung haben nun gezeigt, dass eine abzählbare Anzahl von Molekülen auch ohne ON-/OFF-Schalten getrennt werden können. Sie wiesen experimentell nach, dass sich Punktobjekte wie Moleküle bis hinunter zu kleinen Abständen von 8 Nanometern klar trennen lassen. Dazu rasterten die Forschenden die Moleküle mit einem Lichtstrahl ab, der in der Mitte eine Intensität von Null hat. Mit anderen Worten, im Zentrum des Beleuchtungsstrahls war nicht ein heller, sondern ein dunkler Fleck mit verschwindender Intensität. Beim Abrastern wird das gemessene Signal – im Falle von Fluoreszenzmolekülen ist es Fluoreszenz – registriert. Für ein einzelnes Fluoreszenzmolekül ist das gemessene Signal Null, wenn sich das Minimum genau über dem Molekül befindet. Sind aber zwei oder mehrere benachbarte Moleküle in der Probe enthalten, so kann das gemessene Signal niemals Null werden. Denn mindestens ein Molekül kann nicht mit der Nullstelle des Beleuchtungslichts örtlich übereinstimmen.
Die Wissenschaftler haben theoretisch und experimentell nachgewiesen, dass sich mit diesem Prinzip des „Abrasterns mit einer Intensitäts-Nullstelle“ sehr genau die Orte der Moleküle bestimmen lassen. Den Forschern gelang es, zwei permanent emittierende Fluorophore in einem Abstand von hinunter bis zu 8 Nanometern zu trennen und auch eine Gruppe von 3 oder 4 Molekülen mit Abständen von etwa 20 Nanometern aufzulösen. „Das ON-/OFF-Schalten gilt seit der Einführung des STED-Prinzips vor über drei Jahrzehnten als notwendige Voraussetzung für optische Hochauflösung. Daher ist das nun beschriebene und experimentell validierte Konzept ein Durchbruch“, erklärt Max-Planck-Direktor Hell.
Thomas Hensel, Erstautor der Studie und Doktorand in Hells Team, bemerkt: „Mit diesem neuen Konzept ist es prinzipiell sogar einfacher, näher beieinander liegende Moleküle räumlich zu registrieren als weiter entfernte. Das war nicht unbedingt zu erwarten, denn es stellt das intuitive Verständnis für Auflösung auf den Kopf.“ Denn bisher galt: Je enger die Moleküle zusammen sind, desto schwerer sind sie aufzulösen. Wenn man wie bisher mithilfe von hellen Lichtflecken trennt und Signalmaxima produziert, so kann man diese aufgrund des Signalrauschens der jeweiligen Moleküle nur schwer auseinanderhalten. „Arbeitet man mit einem dunklen Fleck und untersucht die Abweichung des erhaltenen Signals von Null, ist das quasi umgekehrt“, ergänzt Hell.
Abbildung mit Wellen ohne Auflösungsgrenze
Für ihre Ergebnisse sehen die Max-Planck-Wissenschaftler ein breites Potenzial: „Die Idee der Auflösung mit dem Minimum ist nicht nur für fluoreszierende Moleküle anwendbar, sondern für Punktobjekte ganz generell. Und auch nicht nur für optische Wellen, also Licht, sondern prinzipiell für alle Wellen“, so Hell. Auflösen ohne ON oder OFF ist wichtig, weil so alle Moleküle ohne zeitliche Unterbrechung beobachten werden können – und das bei kleinsten Abständen.
Das eröffnet eine weitere Anwendung: Werden molekulare Maschinen, die aus einer Vielzahl von Proteinen bestehen, an unterschiedlichen Stellen mit konstant leuchtenden Molekülen markiert, können Forschende deren zeitliche Positionsveränderung auf kleinstem Raum verfolgen. Winzige Bewegungen von molekularen Maschinen wären so „filmbar“. Dies könnte helfen, zukünftig Medikamente zu entwerfen, die diese Proteine – je nach Bedarf – in ihrer Arbeit unterbinden oder unterstützen. Indem die Mikroskopiemethode Einblicke in die Funktionsweise von Proteinen gewährt, könnte sie die Entdeckung von Medikamenten sogar beschleunigen.
Wissenschaftliche Ansprechpartner:
Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Stefan W. Hell
Direktor am Max-Planck-Institut (MPI) für Multidisziplinäre Naturwissenschaften und am MPI für medizinische Forschung
Abteilung NanoBiophotonik und Abteilung Optische Nanoskopie
Tel.: +49 551 201-2500
E-Mail: stefan.hell@mpinat.mpg.de
Originalpublikation:
Hensel, T. A.; Wirth, J. O.; Schwarz O. L.; & Hell, S. W.: Diffraction minima resolve point scatterers at few hundredths of the wavelength. Nature Physics (2025).
https://doi.org/10.1038/s41567-024-02760-1
Weitere Informationen:
https://www.mpinat.mpg.de/4938808/pr_2502 – Original-Pressemitteilung
https://www.mpinat.mpg.de/de/hell – Webseite der Abteilung NanoBiophotonik, MPI für Multidisziplinäre Naturwissenschaften
https://www.mr.mpg.de/abteilungen/optische-nanoskopie – Webseite der Abteilung Optische Nanoskopie, MPI für medizinische Forschung
Bilder
Mit einem Beugungsminimum in der Beleuchtung können gleichzeitig emittierende, identische Fluorophor …
Thomas A. Hensel
Max-Planck-Institut für Multidisziplinäre Naturwissenschaften
Merkmale dieser Pressemitteilung:
Journalisten, Wissenschaftler, jedermann
Biologie, Physik / Astronomie
überregional
Forschungsergebnisse, Wissenschaftliche Publikationen
Deutsch
